La reina Isabel moría en 1504 y en su testamento nombraba a su hija Juana como reina propietaria de Castilla y León. Fernando tenía esperanzas de conservar el Gobierno en nombre de su hija, pero la actitud de una parte de la nobleza castellana, que se acercó a Felipe -quien alegaba una supuesta locura de Juana para incapacitarla de sus funciones y quedarse él como regente-, le obligó a retirarse a Aragón.
Durante algún tiempo Felipe el Hermoso gobernó en Castilla pero la noticia de su muerte agravó el desequilibrio mental de Juana por lo que que Fernando asumió nuevamente el Gobierno de Castilla en 1506. Juana no deseaba el Gobierno del reino y mandó llamar a su padre para que se hiciera cargo de los asuntos de Estado como regente de Castilla.
Tras la muerte de Felipe el Hermoso y ante las evidentes muestras de enajenación mental de Juana, se decidió recluirla en Tordesillas en 1509, donde llevó una vida de retiro que acrecentó aún más su problema mental hasta que falleció, 46 años después, el 12 de abril de 1555.
Movimiento comunero
El levantamiento comunero (1520) la reconoció como soberana en su lucha contra Carlos I. Sin embargo, la reina nunca tomó partido en esta guerra. Después del incendio de Medina del Campo, el gobierno del cardenal Adriano de Utrech se tambaleó. Muchas ciudades y villas se sumaron a la causa comunera, y los vecinos de Tordesillas asaltaron el palacio de la reina obligando al marqués de Denia a aceptar que una comisión de los asaltantes hablara con doña Juana. Días más tarde Juan de Padilla se entrevistó con ella, explicándole que la Junta de Ávila se proponía acabar con los abusos cometidos por los flamencos y proteger a la reina de Castilla, devolviéndole el poder que le había sido arrebatado, si es que ella lo deseaba. A lo cual doña Juana respondió: «Sí, sí, estad aquí a mi servicio y avisadme de todo y castigad a los malos». El entusiasmo comunero, después de esas palabras, fue enorme. Su causa había de ser legitimada por el apoyo de la reina. A partir de ahí el objetivo de los comuneros sería, en primer lugar demostrar que doña Juana no estaba loca y que todo había sido un complot, iniciado en 1506, para apartarla del poder; y después, que la reina, además de con sus palabras, avalara con su firma los acuerdos que se fueran tomando. Para ello, la Junta de Ávila se trasladó a Tordesillas, que se convertiría por algún tiempo en centro de actuación de los comuneros. Después de estos cambios, todos, incluso el cardenal, afirmaban que doña Juana «parece otra» porque se interesaba por las cosas, salía, conversaba, cuidaba de su personal y, por si fuera poco, pronunciaba unas atinadas y elocuentes palabras ante los procuradores de la Junta.